基因敲除技术
基因敲除(gene knockout)又称基因打靶(genetargeting),是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。通过对生物活体遗传信息的定向修饰(包括基因灭活、点突变引人、缺失突变、外源基因定位引入、染色体大片段删除等),并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传并 表达突变的性状,从而研究基因功能等生命科学的重大问题,以及提供相关的疾病治疗、新药 席选评价模型等。基因打靶技术的产生和发展建立在胚胎干细胞和同源重组技术的基础之上。
同源重组的概念是 20 世纪 70 年代初在酵母研究中发展起来的,与酵母完全不同的是,哺乳动物细胞中同源重组的概率非常低,直到 1985 年 ,Smithies 等人才首次报道在人类肿瘤细胞中实现了人工打靶载体和内源β-球蛋白基因间的同源重组。1987 年,Smithies 和 Capecchi 的研究小组在小鼠 ES 细胞中分别实现了Hprt(次黄嘌呤磷酸转移酶) 基因的定位剔除,并各自在权威性的 Nature 和 Cell 杂志上向世界公布了他们的成果,这标志着基因打靶技术的诞生。短短的 10 多年时间里,基因打靶技术革命性的改变了生命科学研究的面貌,成为研究基因功能的有力手段。在基因打靶技术十多年的发展和应用过程中,呈现出几个明显的发展趋势。一是通过条件型基因剔除技术在时间和空间上对基因敲除进行调控,使引入的基因能够在特定组织、特定发育阶段或特定的诱导条件下表达。在这方面尤以基于Cre-LoxP重组酶系统应用的最为广泛。二是发展满足大规模基因功能研究需要的随机基因敲除技术,一种称为基因诱捕 (gene traping) 的策略得到了广泛的应用。利用基因诱捕可以建立一个携带随机插入突变的 ES 细胞此,节省大量筛选染色体组文库以及构建特异性打靶载体的工作和费用,从而能更有效、更迅速的进行小鼠染色体组的功能分析。三是通过基因敲人(gene knock-in) 技术在基因组中引入精细突变以研制精确模仿人类疾病的动物模型。"Hit and Run"法、"Tag and Exchange" 法以及基于重组酶系统的方法是目前较为常用的用于诱导精细突变的方法。目前,小民的基因敲除已经达到定时、定位、定点的水平。1996年Wilmut等人研究成功体细胞核移植技术,为哺乳动物的基因敲除提供了一条新的技术路线。应用体细胞核移植与基因打靶技术不仅得到了敲除基因的小鼠,而且美国密苏里大学和英国 PPL 公司还分别于2001年构建成敲除了部分α-Gal基因的克隆猪。
以胚胎干细胞为受体细胞的基因敲除技术程序如下。
( 一 ) 打靶载体的构建
把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的 DNA 分子重组到带有标记基因(如 neo 基因,tk 基因等)的载体上,此重组载体即为打靶载体。常用的打靶载体根据目的的不同有两种。
1. 置换型载体 (Ω型 )
为了使某一基因失去其生理功能,这时所要设计的置换型打靶载体应包括含有此靶基因的启动子及第一外显子的 DNA 片段及标记基因等成分。在打靶过程中,断裂位点位于同源序列的外侧或两侧,选择基因位于同源目的序列内部或外侧,载体DNA 同源目的序列与染色体 毗点发生两次同源重组。载体的同源序列取代染色体靶位序列。
2. 插入型载体 （O 型）
如为了把某一外源基因引人染色体 DNA 的某一位点上,这种情况下应设计的插入型载体要包括外源基因(即目的基因)、同源基因片段及标记基因等部分。在打靶过程中,断裂位点位于同源序列内,选择基因紧邻同源目的序列,载体 DNA 同源序列与染色体靶位点发生一次同源重组,整个载体整合到染色体靶位点上。